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色谱柱管理规程(终极版)

文章出处:亚洲游戏 人气:发表时间:2020-11-05 12:47

  色谱柱管理规程 题目: 明胶检验操作规程 起草人: 起草日期: 颁发部门: 质量部 编码: JS1309· 109-04 部门审核: QA 审核: 审核日期: 替代: JS1309· 109-03 批准人: 批准日期: 执行日期: 页数: 共 3 页 分发部门: 质量部、 中心化验室 1.目的: 明确色谱柱的管理和操作方法及要求。 2.范围: 本操作规程依据《中国药典》 2010 年版二部第 460 页及公司内控标准, 适用于明胶的检验。 3.职责: 质检员负责执行, QC 主管、 质量部长负责监督检查。 4.内容: 4. 1 色谱柱的常规分类 高效液相色谱柱通常分为正相柱和反相柱。 正相柱大多以硅胶为柱, 或是在硅胶表面键...

  色谱柱管理规程 题目: 明胶检验操作规程 起草人: 起草日期: 颁发部门: 质量部 编码: JS1309 109-04 部门审核: QA 审核: 审核日期: 替代: JS1309 109-03 批准人: 批准日期: 执行日期: 页数: 共 3 页 分发部门: 质量部、 中心化验室 1.目的: 明确色谱柱的管理和操作方法及要求。 2.范围: 本操作规程依据《中国药典》 2010 年版二部第 460 页及公司内控标准, 适用于明胶的检验。 3.职责: 质检员负责执行, QC 主管、 质量部长负责监督检查。 4.内容: 4. 1 色谱柱的常规分类 高效液相色谱柱通常分为正相柱和反相柱。 正相柱大多以硅胶为柱, 或是在硅胶表面键合-CN, -NH 等官能团的键合相硅胶柱; 反相柱填料主要以硅胶为基质, 在其表面3键合非极性的十八烷基官能团(ODS) 简称为C18 柱。《中国药典》 中以C18 柱最为常用。 4.2 色谱柱的采购及验收 4.2.1 购买前需要了解所分析的化合物的理化性质, 如所含化合物的数目、 化合物的化学结构(官能团) 、 化合物的分子量、 化合物的 pKa 值、 化合物的 UV 光谱图、 化合物在样品中的浓度范围以及溶解度等等。 根据以上化合物的性质, 判断所需色谱柱的相应属性, 如(以反相柱为例)色谱柱的担体(大多数使用硅胶微粒) 、 硅胶粒径、 硅胶孔径以及 A 型或 B 型, 键合相的性质,单位质量填料的表面积、 含碳量, 键合相的键合方式, 封端与否、 几次封端, 以及是否为亲水柱,pH 值使用范围等等。 以上的信息如果不清楚, 可将自己要分析的化合物性质与色谱柱生产厂家联系, 他们会有相应的推荐可作为参考。 4. 2. 2 新购色谱柱在使用前, 要进行柱的性能测试, 测试液和测试方法可向色谱柱销售员直接索取, 如果测试达不到要求, 可以依此退货, 并将结果保存起来, 作为今后评价柱性能变化的参考。 4. 2. 3 每一根新进的购色谱柱购买后需要登记标识色谱柱的应用范围, 色谱柱必须造册登记,内容包括: 生产公司、 品名、 型号、 规格、 购进时间、 启用时间、 单价等。 每次使用需登记. 4. 3 色谱柱的使用 4. 3. 1 色谱柱的安装 安装色谱柱时应使流动相方向与色谱柱标签上箭头所示方向一致, 否则可能出现倒峰, 并损坏色谱柱。 使用PEAK头连接色谱柱时, 应使PEAK管头抵到色谱柱两端螺口底部, 避免产生死体积导致峰拖尾及柱效下降。 4. 3. 2 色谱柱首次使用 有的色谱柱由于出厂后长时间未使用, 两端的保存液会有蒸发损失, 所 以刚购买的色谱柱首次使用时需用甲醇或乙腈冲洗, 冲洗量为柱体积的 15 倍。 在连续流出液体前应不接入检测器。 4. 3. 3 色谱柱的日常使用 4. 3. 3. 1 样品的前处理 使用 0. 45m的过滤膜过滤除去微粒杂质。 4. 3. 3. 2 流动相的配制 使用色谱纯溶剂配制流动相, 水要为超纯化水, 使用 0. 45m滤膜过滤, 除去微粒杂质, 用前脱气。 使用合适的流动相可延长色谱柱的使用寿命, 提高柱性能。 4. 3. 3. 3 流速的选择 柱效是柱中流动相线性流速的函数, 使用不同的流速可得到不同的柱效。 对于一根特定的色谱柱, 要追求最佳的柱效, 最好使用最佳流速。 对内径为 4. 6mm的色谱柱,流速一般选择 1ml/min, 对于内径为 4. 0mm柱, 流速选择 0. 8ml/min为佳 4. 3. 3. 4 柱温的选择 柱温一般为常温, 有时须配备柱温箱, 保证分析结果的重现性, 提高柱效, 降低柱压, 保证检测的稳定性. 4. 4 注意事项: 4. 4. 1 如果不是亲水型色谱柱, 不能用小于 5%的有机相作为流动相, 易造成疏水坍塌色谱柱柱效急剧下降且不能复原。 4. 4. 2 色谱柱不能发生剧烈震荡, 容易使柱床断裂, 造成肩峰, 柱效下降, 导致报 4. 4. 3 使用色谱级溶剂, 可提高色谱柱的分析性能, 延长色谱柱的使用寿命。 4. 4. 4为保证固定产品的检验稳定性与及时性, 色谱柱一般都有规定的使用的检验品种, 不可随意混用。 4. 4. 5 如果色谱柱长时间不用, 应定期(约 1 个月) 用甲醇冲洗避免柱床发生干裂导致报废。 4. 4. 6 进行分析前用足够的时间来平衡色谱柱, 一般冲洗至基线mAbs) 再进样。 4.5 色谱柱的清洗 使用完含有缓冲液的流动相, 先用与样品所要求流动相比例相似有机溶剂与水充分(含水比例不可过高) 冲洗色谱柱, 约 15 倍的柱体积, 再用甲醇或乙腈冲洗保存。 4. 6 色谱柱的维护保养 4. 6. 1 常见色谱峰型不对称(拖尾或前延) 色谱柱原因 a. 色谱柱堵塞筛板污染 b. 进口处填料有凹陷(色谱柱坍塌); c. “污物” 在柱进口处积聚; d. 色谱柱填料存在强吸附(死吸附); e. 重金属污染; f. 键合相脱落, 硅羟基效应; 4. 6. 2 根据上述原因, 用以下方法维修及再生 a. 更换筛板或将筛板超声处理清洗干净; b. 小心拧开柱接头, 用洁净小钢将柱头填料取出 1~2mm 高度(注意把被污染填料取净)再把柱内填料整平。 然后用适当溶剂湿润的固定相(与柱内相同) 填满色谱柱, 压平, 再拧紧柱接头。 这样处理后柱效能得到改善, 但是很难恢复到新柱的水平。 c. 如果厂家说明书允许, 可用乙腈将色谱柱反冲, 反冲时流速不可过高, 以 0. 5 为宜, 冲洗 1 小时。 d. 对于填料存在强吸附的再生: 去除脂类可用四氢呋喃、 乙腈或甲醇洗涤;去除蛋白质可用乙腈、 丙醇和 1%三氯乙酸进行梯度洗脱;一些高疏水性化合物可用乙腈或甲醇洗脱,同时反复注入 100-200ml 的四氢呋喃。

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